3.4.Izolace DNA
DNA byla připravována standardně a výhradně pomocí komerčních izolačních setů firmy QIAGEN a BOEHRING MANNHEIM, souprav pro izolaci DNA z tkání QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN (katalog č.51308), a High Pure PCR Template Preparation Kit BOEHRINGER MANNHEIM (katalog 1796828), protokoly pro izolaci DNA z tkání.
Souprava na přípravu DNA
Postup:
k 0,2-0,5 g tkáně bylo přidáno 180 ul lytického pufru ATL (4M urea,100mM Tris,200mM EDTA) a 20 ul roztoku s 0,8 mg Proteinázy K. Při 56 C bylo tráveno 4 hodiny, následně 18 hodin při 37 C. Poté bylo přidáno 180 ul AL pufru (6M quanidin-HCl,10mM urea,10 mM Tris-HCl,20% Triton X-100) a pro promíchání inkubování 10 minut při 70 C. Poté bylo přidáno 210 ul 99% ethanolu, vortexováno 30 vteřin.Obsah přemístěn do izolační kolonky s adsorbční vrstvou a inkubováno 1 minutu. Stočeno při 8000 ot/min.,dvakrát promyto 500 ul slaného alkoholu (20 mM NaCL a 2mM Tris-HCL v ethanolu) centrifugací 1 minutu při 8000 a 13000 ot/min. Absorbovaná DNA se vymyje 2 x 200 ul elučního pufru AE (10 mM Tris pH 8,5) při teplotě 70 C centrifugací po dobu 1 minuty při 8000 otáčkách. Roztok DNA je stabilní při teplotě kolem 4 C, archivovatelný po řadu let při -20 C (- 80C) bez častého rozmrazování. Je přímo použitelný pro PCR reakční směs. Výtěžek izolace je z cca 0,2 g tkáně kolem 50 ug nukleových kyselin při čistotě s indexem kolem 1.9 DNA poměru absorbance A 260/A280 nm (poměru absorbace nukleových kyselin a bílkovin ve vzorku).
3.5.Materiál a metoda PCR
3.5.1.Úvod
Polymerázová řeťezová reakce PCR (Polymerase chain reaction) jemoderní metoda velmi účinného zmnožení a detekce specifické DNA vypracovaná v roce 1983 v laboratořích Cetus Corporation v Kalifornii,prezentovaná veřejně od roku 1984 K.B.Mullisem a od téhož roku také patentovaná.(Mullis,K.B.,Faloona,E.A.1996,14) K požitelné účinné detekci hledané specifické DNA je třeba mimozákladních složek pro syntézu DNA (nukleotidy,Mg inoty,enzym polymerázu a pufrovací systém) malé množství předlohy - primeru vybrané originální sekvence specifické pro ten který druh nositele DNA. Při použití vhodného tepelného profilu rakce mnohokrát opakované dojde k produkci tak velkého množství pomnožené části originální DNA, že je ji možné po separaci elektroforézou znázornit, porovnáním s velikostním markrem a pozitivním kontrolou identifikovat, případně kvantifikovat. Negativní kontroly přípravy a amplifikace složek reakce bez specifické DNA
a kontroly s nespecifickou DNA, potvrdí věrohodnost nálezu. Případná následná hybridizace nebo sekvenace produktu PCR potvrdí též náležitost amplifikátu k DNA hledaného agens.
Příprava mixů se vzorky
3.5.2.Reakční směs
Pro vyšetřování byly použity komerční reakční směsi tzv.master mixy od firem QIAGEN a ROCHE. Pro PCR s horkým startem,který zabraňuje vzniku nespecifických produktů byl použit HotStarTaq Master Mix Kit QIAGEN (katalog č.203445) a pro stadardní postup PCR Master ROCHE (katalog č.1 636 103).
Mixy ve finální koncentraci obsahují v 100 ul: 2,5 jednotek Taq DNA polymerásy 10mM Tris-HCl,50mM KCl,1,5mM MgCl2 0,005% Brij 35 ICI,nukleotidy dATP,dCTP,dGTP,dTTP všechny v koncentraci po 0,2 mM.Hodnota pH mixu je 8,3. Master mix pro horký start firmy QIAGEN obsahuje HotStar Taq Polymerázu,která se aktivuje zahřátím na 95 C po dobu 15 minut,navíc obsahuje (NH4)2SO4.Další podrobnosti výrobce neuvádí.
Předpis na 100 ul PCR mixu při použití komerčních mixů 2x koncentrovaných:
3.5.2.Vybrané identifikační primery
Uvedené primery pro identifikaci jednotlivých agens rutinně používá Národní laboratoř pro lymeskou borreliózu Státního zdravotního ústavu v Praze.
Přehled primerů používaných k identifikaci izolované DNA
zkratka: sekvence: pro identifikaci druhu:
původ z genu: velikost produktu:
anil.teplota, koncentrace iontů Mg,koncentrace primeru,citace
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
1.*bb´
b 5-GAT AAA AAC GAA GAT AAT CG-3 Borr.burgdorferi (evrop.druhy)
b´ 5-ACT AGG ATC TGT GGA TAT TC-3 produkt: 356 bp
an.teplota: 37 C, 1,5 mM MgCl2 , konc. 0,3 uM
(ROSA,P.A.,1991,15)
2.**cc´
c 5-CCA ACT TTA TCA AAT TCT GC-3 Borr.burgdorferi (všechny druhy)
c´5-AGG ATC TAT TCC AAA ATC-3 produkt: 123 bp
an.teplota: 37 C,(55*) 1,5mM MgCl2,konc.0,3 uM
(ROSA,P.A.,1991,15)
3. BGA 5-GGG ATG TAG CAA TAC ATC T-3 Borrelia garinii
BGB 5-ATA TAG TTT CCA ACA TAG T-3 16SrRNA produkt: 574 bp
an.teplota: 47 C, 1,5 mM MgCl2,konc. 0,5uM (MARCONI.,1992,16)
4. VSA 5-GCA TGC CAA GTC AAA CGG A-3 Borrelia afzelii
VSB 5-ATA TAG TTT CCA ACA TAG C-3 16SrRNA produkt: 591 bp
an.teplota: 47 C, 1,5 mM MgCl2,konc. 0,5uM (ROSA,P.A.,1991,17)
5. ES1,2
P15 5-AAA GCC TGA TCC AGC TAT GCC G-3 Ehrlichia speciés
M7 5-CCG ACA ACG TAT TCA CCG TGG C-3 16SrRNA produkt: 979 bp
an.teplota: 60,5 C 2,5 mM MgCl2, konc.0,5uM
(PC/GENE ,Fidler,Z.,Hulinska D.,1976)
6. OSPA-L,R5
L5 5-TGG ATC TGG AGT ACT TGA AGG CGT-3 Borrelia burgdorferi
R5 5-AGT GCC TGA ATT CCA AGC TGC AGT-3 produkt: 448 bp
an.teplota: 68 C, 2 mM MgCl2, konc O,5uM
(Manak,M.M a kol.,1997,18)
7. EBV TC 67,69,BMRF1
TC67 5-CAG GCT TCC CTG CAA TTT TAC AAG CGG-3 Epstein-Barr virus
TC69 5-CCC AGA AGT ATA CGT GGT GAC GTA GA-3 BMRF1 produkt: 287 bp
an.teplota: 58 C, 1,5 mM MgCl2,konc.0,25uM
(Fiedler,Z.,Hulinska,D.,1976)
8. CMV 028,029
028 5-AAA GAG CCC GAC GTC TAC TAC ACG T-3 Cytomegalovirus
029 5-CCA GGT ACA CCT TGA CGT ACT GGT C-3 pp65 produkt: 150 bp
an.teplota: 55 C,1,5mM MgCl2, konc.0,5uM (Yaia a kol.1990,19)
*)primery použité při prvním amplifikačním kroku v nested PCR
**)primery použité jako vnitřní v druhém ampl.kroku v nested PCR
(Melchers,W.,a kol.,1991,20)
3.5.3.Teplotní profil PCR
Termální cykler pro syntézu DNA
Prakticky byl používán obecně doporučovaný teplotní profil pro PCR jednoktokovou při schématu:
1. předehřátí 95 C po dobu 1 minuty
35 krát opakovaný cyklus
2. denaturace 94 C po dobu 1 minuty
3. anniling 37-68 C po dobu 30 vteřin
4. prodlužování 72 C po dobu 1minuty a 30 vteřin.
1.
předehřátí
95 C
60 vteřin(15 min.)
1x
2.
denaturace
94 C
60 vteřin
35x
3.
anniling
37-68 C
30 vteřin
35x
4.
prodlužování
72 C
90 vteřin
35x
5
závěrečné prodloužení
72 C
10 minut
1x
Od uvedeného obecného schématu teplotního profilu reakce se liší profil PCR s horkým startem (HotStar), kde je předehřátí prodlouženo na 15 minut. Annilingová teplota rozhoduje o speificitě produktu podle dodržení vypočtené teploty. Teplota se vypočítává podle poměru obsahu párů nukleotidových basí A-C a G-C a je určena pro ten který primer.
3.6.1.Identifikace produktu.
Produkt vzniklý v reakční směsi za přítomnosti specifických primerů a při učeném teplotním režimu se rozdělí elektroforeticky na agarózovém gelu a po obarvení ethidiumbromidem a po porovnání s velikostním DNA markrem se odečítá v procházejícím ultrafialovém světle.Produkt je možné ještě verifikovat následnou hybridizací produktu, případně jej podrobit analýze restrikčními enzymy.
Koncentrace agarózového gelu se řídí podle velikosti produktu.Při produktu s velikostí 100-200 bp je koncentrace 2-3% ní, u produktů 300-500 bp je to koncentrace 1,5 % ní, při velikosti kolem 1000 bp stačí koncentrace kolem 1%. Ethidium bromid 10mg% vodný roztok se přidává přímo do rozpuštěného agarózového gelu v do finální koncentrace 0,1-0,5 ul/ml.Amplifikát se mísí v poměru 1:6 s 6x koncentrovaným vazebným roztokem, který obsahuje bromfenolovou modř(0,25%) xylen cyanol FF(0,25%),EDTU(6mM) a Ficoll 400 polymer (15%) pH 8,0. Vazebný roztok umožní sledovat pohyb pro- duktů amplifikace (bromthymolová modř putuje v oblasti 300 bp, xylen cyanol FF v oblasti 1000 bp)EDTA zastavuje činnost zbytků polymerázy za nespecifické teploty a inhibuje produkt pro případnou kontaminaci v následných PCR stejnými primery. Ficcoll váže amplifikovanou DNA a svoji vahou ji strhává na dno jamky v gelu, výsledkem pak je ostřejší obrys amplifikačního bendu v gelu. Elekroforéza probíhá v Tris-EDTA-kys.octová pufru (TAE 1x:Tris base 40mM,kys.octová 40mM, EDTA 1mM)při pH 7,5 působením stejnosměrného elektrického proudu 90 V,(1-10 V/cm) 120 mA po dobu 60 minut.Agaróza je rozpuštěna ve stejném pufru TAE (1x). Gel s produkty po proběhlé elektroforéze se odečítá proti velikostnímu markru v ultrafialové oblasti světla (254 nm). Dokumentuje se fotografováním před červený filtr na černobílý negativní panchromatický film 30 vteřin při cloně 5,6-8.
| HotStarTaqMaster Mix QIAGEN (ROCHE) | 50,00 ul |
| primer + (50pmol/1ul) | 1,00 ul |
| primer - (50pmol/1ul) | 1,00 ul |
| templátová DNA |
20,00 ul |
| destilovaná sterilní voda pro PCR | 28,00 ul |
Vzorky s pozitivní genomovou i plasmidovou DNA B.Burgdorferi
