Tvorba a sbírky

4.0.Výsledky

Bylo vyšetřeno  69 vzorků tkání  patřících 17 druhům  zvěře a tři vzorky povrchových vod z různých lokalit zkoumané honitby.

Tabulka 1: Vyšetřené vzorky druhů, počtu jedinců a jejich tkání

Celkově  bylo  odebráno  nejméně  dvojnásobné  množství vzorků od  čtyřiceti  druhů  zvířad  a   živočichů.Pro  časové  omezení  pro odevzdání práce nebylo možné uzavřít vyšetření všech vzorků.Pokud to bude možné budou další výsledky uvedeny v doplňku této práce.

Tabulka 2: Výsledky vyšetření všech vzorků

Tabulka 3: Pozitivní nález DNA Borrelia burgdorferi sensu lato  u jednotlivých druhů

Tabulka 4: Pozitivní nález DNA Ehrlichia speciés  u jednotlivých druhů

Tabulka 5: Pozitivní nález DNA EB-viru u jednotlivých druhů

Při  hodnocení výsledků  bylo jistým  překvapením vysoké procento pozitivních  vzorků u  vyšetřovaných druhů.Na  druhé straně byl  nízký  nález  DNA   Borrelia  garinii,  které  jsou  hlavním představitelem  infektů  u  neuroborelióz  a  absence pozitivních výsledků u  DNA cytomegalovirů. Průkaz specifické  DNA Borrelií a Ehrlichií v  rybniční vodě odebrané  v srpnu v  únětickém rybníku bylo  největším  překvapením  a  bude  nutné  tento  nález ověřit opakovaně i v jiných podobných nádržích. Izolace z jednotlivých tkání byla nejúspěšnější  z prsního svalu (ve 34%)  v tkáni ptačí brady a v krvi (po 11,4%) a v tkáních klíštěte (v 8,6 %). Podle biotopu pocházely pozitivní vzorky od řeky (42,9%) z louky v 20 % a  z polí v 8,6 procentech.Nejčastější  lokalita, kde byly získány pozitivní  vzorky byly Roztoky (45,7%)  Únětice (37,1%) a Lysolaje  (8,6%).Pro  odběr  pozitivních  vzorků byl neúspěšnější měsíc  září  (11  x),  srpen  (7  x),říjen  (6  x) prosinec (4x), listopad a duben (3x).

Z uvedených výsledků je pravděpodobné,že přenost infekčního agens u pathogenních  borrelií,   ehrlichií  a  EBV  je   možný  i  při manipulaci se zvěřinou při jejím zpracování, dokonce při kontaktu s infikovanou vodou nádrží, kde se zdržují tažní vodní ptáci.

5.0.Diskuse

Přímý   průkaz   DNA   vybraných   infekčních   agens  v  tkáních vyšetřovaných   druhů   zvířat   znamená   přítomnost  specifické DNA,poukazuje  přinejmenším   na  kontakt  s   uvedeným  původcem některých  lidských  infekcí.Nemusí  však  v  tomto  případě  být přítomen  ve tkáních  vždy životaschopný  a virulentní  organismus schopný  nakazit   člověka  při  manipulaci  s   úlovkem  a  jeho kuchyňským zpracováním.  Zjištění by měla  být doplněna pozitivní kultivací  zjištěných organismů  ze stejného  materiálu z kterého byla izolována DNA.Velkým nebezpečím případné kontaminace vodních ptáků se jeví možnost ulpívání  DNA nebo celých mikroorganismů na povrchu těla z kontaktu s  infikovanou vodou. Otázkou je jak může přežít  celkem citlivý  intracelurální mikroorganismus  jako jsou borrelie i ehrlichie v prostředí chovného rybníku s bohatou savčí i ptačí faunou, navíc v prostředí ve kterém se krmí v létě kachny i rybí násada.Je snad možné, aby  zmíněné organismy přežívaly i v prvocích a podobných vodních organismech. Závažné je zjištění, že nejvíce pozitivních vzorků bylo zjištěno u vodních tažných ptáků, které mohou,  jak naznačují i  některé zahraniční práce  roznášet infekční agens jak  daleko na sever, tak na  jih při pravidelných tazích.Zjištění, že by mohly borrelie pronikat porušenou pokožkou do lidského organismu i z vodního prostředí například při koupání ve znečistěných rybnících je  velmi závažné.Průzkum bude rozšířen na  další vodní  plochy, na  odběr vody  v jednotlivých  obdobích roku.  Stejně tak  bude vyšetřen  větší okruh  ptačích i  savčích druhů,  které   se  zdržují  na  vodních   plochách,  případně  v jejich  bezprostřední  blízkosti.Přítomnost  zkoumaných  agens  u klíšťat je  mimo jakoukoliv pochybnost  a stále si  podrží statut nejaktivnější vektoru zkoumaných infekcí, mimo viru CMV. U průkazu  DNA  Ehrlichia  species bude  nutné  použít další specifické   primery,arbitrážní  primery   a  další  identifikaci produktu PCR hybridizací, nebo za použití restrikčních enzymů. To především  proto,  že  procento  pozitivních  izolací  je poměrně vysoké, až nepravděpodobné. Z tohoto  důvodu bylo v tomto případě použito PCR  setu s degenerovanými nukleotidy  - s uracilem,načež nápadně  poklesl  počet  pozitivních  vzorků.  Může  to  však být způsobeno snížením citlivosti reakce. Důležité je, že nejsilnější specifické  reakce zůstaly  u uvedených  vzorků též pozitivní.Zdá se,že zjištění německých autorů o lOO% promoření potkanů Borrelia burgdorferi, kdy byla  DNA  k  PCR  získána  z  ušních  boltců, může být falešně  pozitivní pro kontaminaci z odpadní  vody v níž se zkoumaní jedinci pohybují.(3)

Dalším problémem, který může  ovlivnit výsledek předkládané práce je nestejnoměrná citlivost PCR reakce při použití různých primerů a druhů PCR.  Všeobecně je jednokroková  PCR o několik  řádů méně citlivá  než dvoukroková  nested PCR.  Na druhé  straně u  nested reakce se zvyšuje velmi  riziko kontaminace a falešně pozitivních výsledků.  Laboratoř  která  prováděla  rozbory  neměla dostatečně citlivé primery pro  určení genospeciés (Borrelia garinii,afzelii aj.)  u pozitivních  nálezů získaných  z nested  PCR. Tím  zůstal negativně ovlivněn průkaz Borrelia  garinii ve většině zkoumaných vzorků. Průkaz byl úspěšný pouze  tam, kde byla vyšší koncentrace DNA tohoto genospeciés t.j. například u klíšťat.

6.0.Souhrn

Pilotní  studie  přímého  průkazu  specifické  desoxyribonukleové kyseliny  Borrelia  burgdorferi  sensu  lato,  Borrelia  garinii, Ehrlichia species    ,a Epstein-Barrova viru prokázala přítomnost uvedených  agens v  tkáních předvším  u vodních  tažných ptáků  a další lovné  zvěře.Zdá se, že i  životní prostředí těchto zvířat může  hrát  významnou  úlohu   při  šíření  lidských  onemocnění, především    lymeské    borreliózy, ehrlichiózy,    a    infekční mononukleózy.Nebyla  ani v  jediném případě  prokázána přítomnost DNA  cytomegaloviru.Průkaz  DNA  uvedených  organismů  bude třeba opakovat i v jiných lokalitách, rozšířit vyšetření na další druhy a pokusit  se  doplnit  průkaz  úspěšnými  kultivacemi zjištěných organismů.

7.0.Přehled použité literatury

 1.Burges,E.C.and L.A:Windberg:Borrelia sp.infection of coyotes,

   black-tailed jack rabbits and desert cottontails in southern

   Texas. J.Wildl.Dis.25(1989)45-51

 2.Kimura,K..,E.Isogai,H.Isogai,J.Kamewaka,T.Nishikawa,N.Ishii,

   and N.Fuji: Detection  of Lyme disease spirochetes in the skin

   of naturally infected wild sika deer(Cervus nippon yesoensis)

   by PCR.Appl.Environ.Microbiol.61(1995)1641-1642

 3.Matuschka,F.R.,Endepols,S.,Richter,D.,  et  all:Risk  of urban

   lyme disease enhaced by the presence of rats.J.infect.Dis.,174,

   (1996)5,1108-1111

 4.Hubálek,Z.,Juřicova,Z.,Halouzka,J.,: A Survey of free-living

   Birds as Hosts and "Lessors" of Microbial Pathogens. Fol.zool.

   44(1995)1,1-11

 5.Juřicová,Z.,Hubálek,Z.,Halouzka,J.,Macháček ,P.: Virologické

   vyšetření kormoránů velkých na arboviry. Vet.Med.,38(1993)

   375-379

 6.Olsen,B.,Jaenson,T.G.T.,Noppa,L.,Bunikis,J.,Bergstrom,S.,:

   Lyme borreliosis cykle in seebirds and Ixodes uriae ticks.

   Nature,362(1993),340-342

 7.Weisbrod,A.R.and Johnson,R.C.: Lyme disease and migration

   birds in the Saint Croix river valley,Appl.environ.Microbiol.,

   53(1989)1921-1924

 8.Sprossig,M.,and Anger,G.,: Mikrobiologické vádemékum,Avicenum

   Praha 1979, 412-420

 9.Kolektiv,:  Zprávy  centra  epidemiologie  a  mikrobiologie:8

  (1999)11,

10.Janovská,D.in:Kolektiv:Manuál prevence v lékařské praxi,Státní

   zdravotní ústav Praha (1996)70-72

11.Kolektiv,:  Zprávy  centra  epidemiologie  a  mikrobiologie:8

  (1999)11,

12.Pleiner,R.,:Pravěké dějiny Čech,Academia Praha,(1978)160-186

13.Pachner,R.A.,Zhang,W.F.,Schaefer,H.,Schaefer,S.,O´Neill,T.,:

   J.Clin.Microbiol.,(1998)11,3243-3247

14.Mullis,K.,Faloona,F.,Scharf,S.,Saiki,R.,Horn,G.,Ehrlich,H.:

   Specific   Enzymatic   Amplification   of   DNA  in  vitro:The

   Polymerase  Chain  Reaction.  Cold  Spring  Harbor  Symposia i

   Quantitative Biology 51(1996)263-273

15.Rosa,P.A.,Hogan,D.,Schwan,T.G.,:Polymerase    Chain   Reaction

   Analyses Identify Two Distinct Classes of Borrelia burgdorferi

   J.Clin.Microbiol.,(1991)3,524-532

16,17.Marconi,R.T.,Garon,C.F.,:Identification of a third genomic

   group  of  Borrelia  burgdorferi  trough  signature nucleotide

   analysis and 16S rRNA sequence determination. J.Gen.Microbiol.

   138(1992)533-536

18.

19.Yaia et all.,J.Clin.Microbiol. 28(1990)2608

20.Melchers,W.,Meis,J.,Rosa,P.,Claas,E.,Nohlmans,L.,Koopman,R.,

   Horrevorts,A.,Galama,J.,:     Amplification     od    Borrelia

   burgdorferi  DNA  in  Skin  Biopsies  from  Patients with Lyme

   Disease.J.Clin.Microbiol.,(1991)11,2401-2406

9.0.Přílohy

B I O T O P Y

BIOTOP,NIKA,definice.

I.Soubor  všech  abiotických  a  biotických  podmínek,vytvářející prostředí  organismu  se  nazývá  biotop,česky nejspíše vyjádřeno jako stanovistě.(Rosypal,1994,1) II.Biotop je  souhrn ekologických činitelů  (základních životních podmínek),   působících   na   jistém   místě.   Je   to   hlavně ,teplota,světlo a mechanická povaha prostředí (vody,půdy) apod. (Táborský,1961,4) Rozdělení převzato podle členění publikace Česká zvířena (Komárek 1950,2):

1 . Lesní půdy a přízemí lesa.

2 . Živošišstvo stromové.

3 . Lesní okraje,paseky a plochy jim podobné.

4 . Orná půda.

5 . Louky senné.

6 . Pastviny a divoké travnaté plochy.

7 . Sady a lidská sídla.

8 . Okolí prameništ a horních vodních toků.

9 . Pobřeží dolních toků a řek.

10. Povrch stojatých vod a jejich okolí.

11. Podzemní vody.

12. Studené vody, studánky, bystřiny a potoky.

13. Řeky.

14. Stojaté vody.

Komárkovo rozdělení bylo doplněno o další biotopy podle publikace

Příroda v ČSSR (Čihař a kolektiv,1976,(3)

15. Hory

16. Rašeliniště

17. Slatiny

18. Slatinové louky

19. Výslunné stráně.

20. Step.

21. Písčina.

22. Skály.

23. Kamenité stráně.

24. Sutě.

25. Lomy.

26. Zdi.

27. Opuštěná ohniště.

28. Spáleniště.

Doplnili jsme o další upřesňující odlišné biotopy:

29. Lidske stavby.

30. Jeskyně a jámy.

31. Skládky (s upřesněním druhu).

32. Ladem ležící orná půda.

33. Hnízda, pelechy, brlohy a nory.

34. Stálí ektoparazité teplokrevných živočichů.

35. Stálí ektoparazité studenokrevných živočichů.

36. Stálí endoparazité teplokrevných živočichů.

37. Stálí endoparazité studenokrevných živočichů.

L O K A L I T A

LOKALITA definice:

Lokalita  je přesné  určení místa  ulovení s  uvedením nejblišího většího města.(nejbližší obec,okresní město a zem)Lokalita  se značí: loc. U  lokality se uvádí často nadmořská výška.(Táborský,1961,5

Výškové úrovně lokalit:

Literatura:

k biotopu a lokalitám:

  1. S.Rosypal: Přehled biologie, Sciencia, Praha 1994, str.537

  2. J.Komárek: Česká zvířena, Melantrich, Praha 1950, str.346

  3. J.Čihař  a  kolektiv:  Příroda  v  ČSSR, Práce, Praha 1976,

     str.380

  4. K.Táborský:Metodika  zoologických prací v  muzeích II.díl,

     v Muzejní práci, Národní muzeum, Praha 1961, str.415

  5. K.Táborský:Metodika zoologických prací  v muzeích, II.díl.,

     v Muzejní práci, Národní muzeum, Praha 1961, str.415 a 465.