Komerční souprava na přípravu genomové DNA
Příprava DNA z klíšťat má své specifity proto je zde podrobně popsána.
K izolaci DNA z klíšťat se používá následujícího postupu. Klíště se ponoří sterilní pinzetou (vyžíhanou v plameni a ochlazenou) opakovaně 3x do sterilního roztoku Tris-Edta pufru (AE pufr Qiagen), následně se ponoří do 200 ul sterilní vody pro PCR (Qiagen) a zmrazí se při minus 18-25 C po dobu 60 minut. Poté se nechá rozmrznout v laboratorní teplotě a přidá se 20 ul proteinázy K a 180 ul ATL pufru (vše od firmy Qiagen). Sterilní špičkou se mechanicky rozdrtí o stěnu zkumavky, silně se vortexuje cca 60 s a inkubuje při 37 C přes noc.Druhý den se přidá roztok AL 200 ul (vše Qiagen) důkladně se vortexuje a inkubuje se 10 minut při 70 C. Po inkubaci se přidá 300 ul absolutního alkoholu, důkladně vortexuje 60 s a nalije se na separační kolonky izolačního kitu QIAamp DNA Mini Kit k.č. 51306
Potřeby pro přípravu PCR mixu
QIAGEN.Stočí se při
6000g 1 minutu, promyje se 500 ul AW1 pufru stočením opět při 6000g 1 minutu a následně 500 ul pufru AW2 při 13000g 4 minuty. Následuje ještě jedno stáčení při nejvyšších obrátkách do prázdných kolonek 1 minutu. Následně se umístí kolonky do nových 2 ml ependorfek a napipetuje se 200 ul AE pufru, inkubuje se 1 minutu a stáčí se též 1 minutu m při 6000 g.
Nutností pro přípravu DNA je laminární box který omezuje případnou kontaminaci vzorků z prostor laboratoří.
Poté se přidá na kolonku dalších 200 ul AE pufru a po 5 minutové ikubaci při laboratorní teplotě, se stočí po stejnou dobu a při stejných otáčkách. Dostaneme tak 400 ul roztoku DNA. Pro PCR reakci používáme též od firmy Qiagen mix :Hot StarTag Master Mix Kit (kat.203445).
Pracovní Master mix pak je složen následovně:
Master Mix Qiagen……..500ul
PCR water Qiagen………380ul
+primer roztok 50pmol
v 1 ul…………………... 10ul
-primer roztok 50pmol
v 1 ul…………………… 10ul
Thermocykler s termogradientem pro amplifikaci DNA- prodlužování, zmnožení specifické sekvence bazí DNA vybraného pathogena.
zamíchat a rozplnit do 0,2 ml PCR zkumavek po 18 ul, přidat 2 ul roztoku připravené DNA z klíšťat a amplifikovat v cykleru podle postupu uvedeném pro jednolivé primery s tím ,že je nutné předřadit vždy jeden cyklus pro horký start (15 minut při 95 C!)
Termální blok pro inkubaci vzorků do 120 C, používá se dvou cyklů při 56 C(1-3 hodiny) a při 70 C(10 minut)
Vyšetření PCR je jen skreening, produkt nebyl dále zpracováván.
Produkt je podroben elektroforéze v 1 % agarózovém gelu v TAE pufru o pH 7,5 a s obsahem ethidium bromidu (1 mg%). Srovnává se standardem - DNA markrem, fotografuje se v UV světle a hodnotí se specifický produkt na pozitivní fotografii, proti pozitivní kontrole.Podmínkou je že vyhovuje negativní kontrola ( bez vzniku produktu )jak v negativní kontrole kam byla přidána jen voda pro PCR, tak v kontrole s negativní DNA vyšetřovaného druhu živočicha nebo člověka! Pro potvrzení specifity ,pokud se neprovádí restrikční analýza produktu, hybridizace sondou nebo sekvenace, je nutné použití několika primerů detegujících různé specifické části genů což většinou dobře nahradí další ověření identifikaci specifity reakce.
Fotodomunetace v UV světle, je prováděna na černobílý film fotoaparátem s červeným filtrem. Produkt s DNA vynikne při barvení Ethidiem-bromidem jako zářící oranžový pruh který se sriovnání se stadardem a velikostním markrem DNA.
Výsledek v UV světle Dva svítící pruhy jsou specifické produkty po amplifikaci s DNA Borrelia burgdorferi s.l. s primerem OSPA2 (445bp) a LD-19SrRNA (356 bp).
