Rostlinný pyl dokonale inhibuje reakci PCR!
I pyl spláchnutý deštěm inhibuje v nepatrných množstvích PCR
Duben květen i červen jsou měsíce ,kdy kvete většina rostlin. Je to období, kdy se ve vzduchu vznáší celá oblaka rostliného pylu. Vidíme ho jako prach na světlých površích, hlavně pak na tmavých karoseriích aut jako jemný žlutavý prášek - mikropísek. To vše do doby než přijdou pořádné jarní a letní lijáky a spláchnou pyl do kaluží. Když kaluže vyschnou zustávají na jejich okrajích žluté mapy.Je to koncentrovaný pyl, který lze již nabrat i na lžičku ,kolik ho je.
Nahoře na snímku to je slepený zralý pyl z kousku kraje jedné kaluže. Odebral jsem jej. Jako lopatku jsem použil služební průkaz. I nepatrné množství tohoto pylu reakci zcela zastavilo.Naopak nezralý (nešel setřít)pyl nerozvinuté sedmikrásky nijak reakci PCR neovlivnil.
Kaluže po průtrži mračen ve Šrobárově ulici v Praze 10
Světlejší části na snímkou je pyl po dešti.Tmavší části jsou většinou odkvetlé květy.Snímek byl zhotoven v Praze 10 v Šrobárově ulici 16.5.2008
Ve státním zdravotním ústavu v Praze mám možnost pracovat jako laborant s metodami molekulárně genetické diagnostiky.
Pylové konkrece z kaluže zvětšeno 100x
Kolega RNDr.Jiří Bašta z téhož pracoviště mě svého času sdělil,že byly konány někde pokusy s inhibicí PCR reakce několika zrníčky pylu.
Sdělení jsem si desítku let pamatoval, dosud jsem je však nikdy prakticky nevyzkoušel.
Dole pylové konkrece zvětšeno 400x
V literatuře jsem nikde nenašel ani citaci ani vysvětlení tohoto jevu.V praxi je známa řada chemických inhibitorů.( Z prezentace PCR J.A.Votýpka, Praha 2007)
Pyl vždy plave na povrchu tekutiny i na mixu PCR
V prezentaci která je na těchto stránkách jsem uvedl i jmenovaný pyl.Ten má jistě mnohé společné po fyzikální stránce s talkem i škrobem.
Letos když jsem viděl plno spláchnutého pylu na okraji kaluže jsem se rozhodl prokázat inhibici experimentálně.Vzal jsem do reakce uvedený pyl a v druhé části jsem použil do pokusu i ne zcela rozvitý květ chudobky sedmikrásky.Do mikrozkumavky s 18 ul PCR mixem od firmy QIAGEN s primery pro průkaz plasmidové DNA Borrelie burgdorferi jsem přidal 2 ul DNA Borrelia burgdorferi kmene B31 (roztok o koncentraci 3 ug/1 ml) do všech zkumavek, Do jedné zkumavky jsem přidal cca 20 ul suspenze pylu, do druhé zkumavky přišlo jen pár zrnek pylu stejkného druhu. Do třetí zkumavky přišel stěr z tyčinek květu sedmikrásky, ne zcela rozvité.
Výsledek:
1.Pyl, respektive směs pylu spláchnutého deštěm zcela zabrzdil amplifikaci DNA i v nepatrném, mikroskopickém množství!
2.Nezralý pyl ze semikrásky vůbec neovlivnil tvorbu DNA při PCR a produkt byl specifický i kvatitativně stejný jako kontrola.
Fotografie gelu s výsledkem amplifikace.Jamky 4 a 5 vzorky s přidaným zralým pylem,jamka 6 přidán pyl z nerozvinuté sedmikrásky. Jamky 1 a 3 kontroly bez přídavku pylu.
Záznam v protokolové knize
pylové konkrece zvětšeno 400x
Z tohoto pozorování měl být pro všechny kteří používají PCR diagnostiku následující závěr:
V období ,kdy je ve vzduchu plno pylu je třeba pracovat nejen v bezprašném prostředí, nepracovat při otevřených oknech, ale též myslet i na jinou kontaminaci prostředí a vzorků pylem.Nutné je uvažovat i o přenosu pylu na oděvu a botách, při úklidu laboratoří atd.Sdělení bude doplněno ještě dalšími poznatky v této problematice a fotodokumentací.Nezodpovězena zůstává otázka možné kontaminace tělních tekutin pylem, nebo jeho zbytky během pylové sezóny.
I zdánlivé drobnosti a neshody mohou přispět našemu poznání.
Jiří Antonín Votýpka,Praha 17.5.2008
DOPLNĚNÍ v roce 2010
Prach a hlavně stavební prach paří také mezi významné inhibitory reakce PCR, jak jsem zjistil při rekonstrukci budovy, kde máme laboratoře.
